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层析法筛选珍珠岩的方法

       本发明目的在于为了节约外汇,以国产珍珠岩为原料,从中筛选出用于分离 纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料的方法;提供一种省时,省力,节能的从国 产珍珠岩中筛选层析填料的方法。
      本发明的目的是这样实现的:本发明提供的从国产珍珠岩中筛选用于分离纯 化无细胞百日咳蛋白质的层析填料的方法,包括以下步骤进行筛选:
(1)  首先选择符合食用检测指标的珍珠岩过筛,获得粒度在125-250叫1的为 初筛材料;
(2)       称取步骤(1)获得的初筛材料,加入的蒸馏水,蒸馏水加入量以使珍 珠岩充分悬浮起来为准,之后静置2-5分钟,选择沉降的珍珠岩材料,弃去上部 漂浮物;
(3) 将步骤(2)获得的珍珠岩进一步装柱筛选,用一次性注射器的针筒为 层析柱(l*5cm),底部用合成纤维均匀垫好,把蒸馏水悬浮的珍珠岩装柱,柱床 体积为lml,然后蒸馏水流过珍珠岩的流速大于5-丨t)秒/滴的珍珠岩再一次被弃 去,余下的珍珠岩是可以做为分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料。
     为了得到更好的用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质的层析填料,可以对层析 填料,进一步筛选还包括:
步骤(4)在步骤(3)的柱中用4种PH8.0 Tris-Hcl缓冲液(含NaCl), 按顺序阶段洗脱:将取无细胞百日咳蛋白质溶液lml,加到步骤(3)处理好的国      产珍珠岩为填料的层析柱中,自然流速,用l〇ml试管收集流出液,当样品流尽 后,把收集的流出液用下述4种PH8.0的Tris-Hcl缓冲液(含NaCl)按顺序阶 段洗脱,用编好号的试管收集洗脱液,每管收集lml;
所述的4种PH8. 0含NaCl的Tris-Hcl缓冲液如下:
1.  25mM Tris-Hcl 缓冲液 5ml;
2.  50mM Tris-Hcl 缓冲液含 0.2M  NaCl  5ml
3.  50raM Tris-Hcl 缓冲液含 0.6M NaCl 5ml
4.  50raM Tris-Hcl      缓冲液含 1. 0M  NaCl 5ml。
步骤(5)测洗脱液蛋白质的紫外吸收A280:从步骤(4)中得到的各管收集lml 洗脱液蛋白质,在紫外分光光度计上进行紫外吸光度测定,该蛋白质在280nm处 有吸光度A28(),记录读数。以A28。的数值为纵坐标,收集洗脱液的管号数为横坐标 作图,在图中可以看出分离的效果。对那些没有把蛋白质分离开的和洗脱时流速 慢的珍珠岩又一次被淘汰。选用洗脱时流速快、分离效果好的珍珠岩为层析填料, 分离结果如图1所示,从图1可以看出,国产珍珠岩分离的无细胞百日咳蛋白质 有4个吸收峰。峰1、峰2、峰3、峰4。
还包括进行电泳鉴定分离蛋白质的纯度:步骤4中各蛋白吸收峰的洗脱液分 别收集于一体,用标准纯百日咳蛋白质为对照,所获得峰1至峰4的样品进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶鉴定分离蛋白质的纯度。结果见图2,从图2中可以看出,峰1 含69k和一些杂蛋白质,峰2、峰3分别是PT和FHA。其中峰2、峰3的蛋白质 纯度达80%以上,基本不含杂蛋白。峰4是分离的杂蛋白质,弃去不要,根据分 离纯化的效果和洗脱速度,确定哪种珍珠岩作为层析填料。用电泳鉴定分离蛋白 质的纯度证明蛋白质69k,PT和FHA是百日咳蛋白质的主要成份,也证明了该 方法的可行性和可靠性。
并可做如下分离纯化无细胞百日咳蛋白质实验进行检验:
1.   测血凝活性检验国产珍珠岩分离纯化百日咳蛋白质的效果。
2.   用SDS-聚丙烯酸胺凝胶鉴定分离蛋白质的纯度。
3.   根据分离纯化的效果和洗脱速度,确定哪种珍珠岩作为层析填料。 本发明的优点:
     本发明提供的从国产珍珠岩中筛选出用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质做层 析填料的方法,所用原料国产珍珠岩货源充足,价格便宜每公斤1.5-3. 0元人民 币,在国外每公斤珍珠岩6美元。该方法简便快速,省时,省力,节能。国产 珍珠岩性能稳定,用于分离纯化无细胞百日咳蛋白质做层析填料易操作。
附图说明
图1是国产珍珠岩分离纯化百日咳蛋白质的图谱 图中峰1.含69k的杂蛋白质层析柱流出液;
峰2. PT ; 峰3. FHA;            峰4.分离的杂蛋白质;
图2珍珠岩分离纯化百日咳蛋白质的SDS-PAGE图 图中:1.层析柱上样蛋白质                                          2.图1中峰1样品
3.图1中峰2样品 4.图1中峰3样品5.标准样品 ,6.图1中峰4样品
图3层析填料国产珍珠岩的电镜扫描照片(放大500倍的照片)



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